ELISA試劑盒免疫組織化實驗代測染實驗計劃

1．實驗計劃
① ELISA試劑盒根據課題的內容選用動物，選用配套的Ab。如Ab—I鼠抗人的抗體，與其他種屬間無 交叉，則不能用其他 動物，而且Ab-Ⅱ必須是羊抗鼠，若PAP法Ab-Ⅲ必須來源于鼠，否則不能連接成復合物。
② 若要比較染色深淺在對照組與實驗組間的差異，在貼片方面貼于同一張載片上，否則無可比性。
③ 選用的試劑可靠，貨源充足，隨時可取。
2．Ab稀釋度 （如系購買的藥盒有工作液和原液）
（1）工作液：無須稀釋
（2）原液：
① 應參照其提供的工作液濃度進行預試驗驗。
如：工作液濃度為1∶1000， 可選1∶500，1∶1000，1∶1500試驗；
若: 1∶500有背景，1∶1000陽性反應稍淺，可選1∶750進行試驗。
② 原液的保存（—20℃）凍存——應選稀度凍存。
③ 若工作濃度大于1∶500則要先將原液稀釋十倍，而后分裝10μl/瓶→凍存（-20 ℃）于 冰箱備用。
④ 關于Ab保存應參照說明書。
（3）Ab濃度的選擇
Ab濃度不可太高或太低，因為Ag-Ab結合需在一定濃度范圍內進行，若一方過剩則形成復合物小且少；極 過剩時已形成的復合物亦會解體而呈現假陰性。——并非Ab濃度越高越好。
3．Ab滴片技術
—— 所滴的抗體應與切片上的組織剛好吻合。
[注意] 滴抗體前需把切片上的水弄干，但不能干片。
要領：甩凈組織周圍的水。
4．PBS洗滌技術
（1）洗滌的目的
① 保證離子濃度和PH值。
② 減少非特異反應（平時Ab不可靠很純）
（2）方法：洗三次，每次5分鐘。
5．Ab孵育技術
（1）必須在濕盒內進行，以防抗體的蒸發和干片。
（2）溫度與時間 4℃：過夜；
37℃：2 h or 參考說明書
6．光鏡控制顯色方法
（1）室內操作：注意溫度與時間的關系，室溫zui宜5分鐘。
（2）染色稍淺亦可拿出，脫水，封片后顏色可加深。
對照組和染色結果的評價
從以下幾 個方面綜合評價：
1．陽性染色特點
① Ag定位，胞漿、胞核、胞膜、間質具有結構性。（非特異性～細胞與組織無區別）
② 染色強度不同：顏色深淺不一（非特異性染色 彌散性均勻）
2．組織切片制作過程的影響
① 固定不良—非特異性染色，顯示不均。
② 邊緣干燥—非特異性染色（常見），加抗體時勿干片。
3．ELISA試劑盒人工假象與特異性結果顯示不在同一平面上。
陽性對照：
用已知抗原陽性的切片與待檢標本同時進行免疫細胞化學染色。對照切片呈陽性結果，標為陽性對照。
陰性對照：
用確證不含已知抗原的標本作對照，應呈陰性結果，稱陰性對照。其實這只是陰性對照中的一種，陰性對照 還應包括空白、替代、吸收和抑制實驗。
▲ 染色失敗的幾種原因：
（1）所染的全部切片均為陰性結果，包括陽性 對照在內。全部（－）原因可能：
① 染色未*嚴格按照操作步驟進行；
② 漏加一種抗體，或抗體失效；
③  底物中所加H2O2 量少或失效；
￥ 復染或脫水劑使用不當
（2）所有切片均呈陽性反應，原因可能是：
① 切片在染色過程中抗體過濃，或干燥了。
② 緩沖液配置中未加氯化鈉和PH值不準確，洗滌不*。
③ 使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反應時間過長。
④ 抗體溫育的時間過長。
⑤ H2O2 濃度過高，呈色速度過快。粘附劑太厚。
（3）所有切片背景過深，原因可能是：
① 未加酶消化處理切片。
② 切片或涂片過厚。
③ 漂洗不夠。
④ 底物呈色反應過久。
⑤ 蛋白質封閉不夠或所用血清溶血。
⑥ 使用全血清抗體稀釋不夠。
（4）ELISA試劑盒陽性對照染色良好，檢測的陽性標本呈陰性反應。
zui常見的原因是：標本的固定和處理不當。