微生物生長的幾種檢測方法

摘要：

　　微生物的檢測，無論在理論研究還是在實踐中都具有重要的意義，本文分生長量測定法，微生物計數法，生理指標法和商業化快速微生物檢測簡要介紹了利用微生物重量，體積，大小，生理代謝物等指標的二十余種常用的檢測方法，簡要介紹了這些方法的原理，應用范圍和優缺點。

　　概述：

　　一個微生物細胞在合適的外界條件下，不斷的吸收營養物質，并按自己的代謝方式進行新陳代謝。如果同化作用的速度超過了異化作用，則其原生質的總量（重量，體積，大小）就不斷增加，于是出現了個體的生長現象。如果這是一種平衡生長，即各細胞組分是按恰當的比例增長時，則達到一定程度后就會發生繁殖，從而引起個體數目的增加，這時，原有的個體已經發展成一個群體。隨著群體中各個個體的進一步生長，就引起了這一群體的生長，這可從其體積、重量、密度或濃度作指標來衡量。微生物的生長不同于其他生物的生長，微生物的個體生長在科研上有一定困難，通常情況下也沒有實際意義。微生物是以量取勝的，因此，微生物的生長通常指群體的擴增。微生物的生長繁殖是其在內外各種環境因素相互作用下的綜合反映。因此生長繁殖情況就可作為研究各種生理生化和遺傳等問題的重要指標，同時，微生物在實踐上的各種應用或是對致病，霉腐微生物的防治都和他們的生長抑制緊密相關。所以有必要介紹一下微生物生長情況的檢測方法。既然生長意味著原生質含量的增加，所以測定的方法也都直接或間接的以次為根據，而測定繁殖則都要建立在計數這一基礎上。微生物生長的衡量，可以從其重量，體積，密度，濃度，做指標來進行衡量。

　　生長量測定法

　　體積測量法：又稱測菌絲濃度法。

　　通過測定一定體積培養液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是，取一定量的待測培養液（如10毫升）放在有刻度的離心管中，設定一定的離心時間（如5分鐘）和轉速（如5000 rpm），離心后，倒出上清夜，測出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測定法是大規模工業發酵上微生物生長的一個重要監測指標。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設定一致的處理條件，否則偏差很大，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營養物，結果會有一定偏差。

　　稱干重法：

　　可用離心或過濾法測定。一般干重為濕重的10-20%。在離心法中，將一定體積待測培養液倒入離心管中，設定一定的離心時間和轉速，進行離心，并用清水離心洗滌1-5次，進行干燥。干燥可用烘箱在105℃或100℃下烘干，或采用紅外線烘干，也可在80℃或40℃下真空干燥，干燥后稱重。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾后用少量水洗滌，在40℃下進行真空干燥。稱干重發法較為煩瑣，通常獲取的微生物產品為菌體時，常采用這種方法，如活性干酵母（activity  dry  yeast, ADY）,一些以微生物菌體為活性物質的飼料和肥料。

　　比濁法：

　　微生物的生長引起培養物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。對某一培養物內的菌體生長作定時跟蹤時，可采用一種特制的有側臂的三角燒瓶。將側臂插入光電比色計的比色座孔中，即可隨時測定其生長情況，而不必取菌液。該法主要用于發酵工業菌體生長監測。如我所使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計，在波長600nm 處用比色管定時測定發酵液的吸光光度值OD₆₀₀，以此監控E.Coli的生長及誘導時間。

　　菌絲長度測量法：

　　對于絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養基上測定一定時間內菌絲生長的長度，或是利用一只一端開口并帶有刻度的細玻璃管，到入合適的培養基，臥放，在開口的一端接種微生物，一段時間后記錄其菌絲生長長度，借此衡量絲狀微生物的生長。微生物計數法

　　血球計數板法:

　　血球計數板是一種有特別結構刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，*有一短橫溝和兩個平臺，兩嵴的表比兩平臺的表面高0.1 mm，每個平臺上刻有不同規格的格網，*0.1 mm²面積上刻有400個小方格。通過油鏡觀察，統計一定大格內微生物的數量，即可算出1毫升菌液中所含的菌體數。這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜于單細胞狀態的微生物或絲狀微生物所產生的孢子進行計數，并且所得結果是包括死細胞在內的總菌數。

　　染色計數法：

　　為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數，而直接用血球計數板法又無法區分死細胞和活細胞的不足，人們發明了染色計數法。借助不同的染料對菌體進行適當的染色，可以更方便的在顯微鏡下進行活菌計數。如酵母活細胞計數可用美藍染色液，染色后在顯微鏡下觀察，活細胞為無色，而死細胞為藍色。

　　比例計數法：

　　將已知顆粒（如霉菌孢子或紅細胞）濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數出各自的數目，即可得未知菌液的細胞濃度。這種計數方法比較粗放。并且需要配制已知顆粒濃度的懸液做標準。

　　液體稀釋法：

　　對未知菌樣做連續十倍系列稀釋，根據估計數，從zui適宜的三個連續的10倍稀釋液中各取5毫升試樣，接種1毫升到3組共15只裝培養液的試管中，經培養后記錄每個稀釋度出現生長的試管數，然后查zui大或然數表MPN（most probably number）得出菌樣的含菌數，根據樣品稀釋倍數計算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物*。

　　平板菌落計數法：

　　這是一種zui常用的活菌計數法。將待測菌液進行梯度稀釋，取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養基在凝固前均勻混合，或將菌液涂布于已凝固的固體培養基平板上。保溫培養后，用平板上出現的菌落數乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數。一般以直徑9cm的平板上出現50-500個菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術。平板菌落計數法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數，而且同時將菌液中的細菌進行了一次分離培養，獲得了單克隆。

　　試劑紙法：

　　在平板計數法的基礎上，發展了小型商品化產品以供快速計數用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養基，其中加入活性指示劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，無色）待蘸取測試菌液后置密封包裝袋中培養。短期培養后在濾紙上出現一定密度的玫瑰色微小菌落與標準紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計數快捷準確，相比而言避免了平板計數法的人為操作誤差。

　　膜過濾法：

　　用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光，活細胞會發橙色熒光，而死細胞則發綠色熒光。

　　生理指標法：

　　微生物的生長伴隨著一系列生理指標發生變化，例如酸堿度，發酵液中的含氮量，含糖量，產氣量等，與生長量相平行的生理指標很多，它們可作為生長測定的相對值。測定含氮量：

　　大多數細菌的含氮量為干重的12.5%，酵母為7.5%，霉菌為6.0%。根據含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測N₂氣法。Dumas測N₂氣法是將樣品與CuO混合，在CO₂氣流中加熱后產生氮氣，收集在呼吸計中，用KOH吸去CO₂后即可測出N₂的量。

　　測定含碳量：

　　將少量（干重0.2-2.0 mg）生物材料混入1毫升水或無機緩沖液中，用2毫升2%的K₂Cr₂O₇溶液在100 ⁰C下加熱30分鐘后冷卻。加水稀釋至5毫升，在580nm的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用試劑做空白對照，用標準樣品做標準曲線。

　　還原糖測定法：

　　還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況，常用于大規模工業發酵上微生物生長的常規監測。方法是，離心發酵液，取上清液，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3分鐘，取出加少許鹽酸酸化，加入Na₂S₂O₃臨近終點時加入淀粉溶液，繼續加Na₂S₂O₃至終點，查表讀出還原糖的含量。

　　氨基氮的測定：

　　方法是，離心發酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02N的NaOH調色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應數刻，加入0.02N的使之變色，根據NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據培養液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長狀況。

　　其他生理物質的測定：

　　P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙酰胞壁酸）等含量以及產酸，產氣，產CO₂（用標記葡萄糖做基質），耗氧，黏度，產熱等指標， 都可用于生長量的測定。也可以根據反應前后的基質濃度變化，zui終產氣量，微生物活性三方面的測定反映微生物的生長。如我所在BMP-2的發酵上，隨時監測溶氧量的變化和酸堿度的變化，判斷細菌的長勢。

　　商業化快速微生物檢測法：

微生物的檢測，其發展方向是快速，準確，簡便，自動化，當前很多生物制品公司利用傳統微生物檢測原理，結合不同的檢測方法，設計了形式各異的微生物檢測儀器設備，正逐步廣泛應用于醫學微生物檢測和科學研究領域。例如：

　　1、抗干擾培養基和微生物數量快速檢測技術結合解決了傳統微生物檢測手段不能解決的難題，為建立一套完整的抗干擾微生物檢測系統奠定了堅實的基礎。中科院廣州分院合作產業處提供的抗干擾微生物培養基，新型生化鑒定管，微生物計數卡，環境質量檢測試劑盒等，可方便的用于多項檢測。

　　2、BACTOMETER 全自動各類總菌數及快速細菌檢測系統可以數小時內獲得監測結果，樣本顏色及光學特征都不影響讀數，對酵母和霉菌檢測同樣高度敏感原理是利用電阻抗法（IMPEDANCE TECHNOLOGY）將待測樣本與培養基置于反應試劑盒內，底部有一對不銹鋼電極，測定因微生物生長而產生阻抗改變。如微生物生長時可將培養基中的大分子營養物經代謝轉變為活躍小分子，電阻抗法可測試這種微弱變化，從而比傳統平板法更快速監測微生物的存在及數量。測定項目包括總生菌數，酵母菌，大腸桿菌群，霉菌，乳酸菌，嗜熱菌，革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌等。