GFP是什么？EGFP與GFP有什么區別？

GFP 綠熒光蛋白(Green Fluorescent Portein，GFP)

綠色熒光蛋白是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體內的生物發光蛋白，當受到紫外或藍光激發時，發射綠色熒光。其*之處在于：它產生熒光無需底物或輔因子，發色團是其蛋白質一級序列固有的來源于水母的氨基酸殘基組成。水母的綠色熒光蛋白很穩定，無種屬限制，已在多種動植物細胞中表達成功并產生熒光。GFP 的熒光受外界的影響較低，另外GFP 的檢測十分方便，而對細胞的傷害極低。(LUYOR-3260RB便攜式GFP激發光源可輕松激發GFP熒光，迅速定位GFP表達位置），由于這些優點，GFP 已經成為檢測體內基因表達及細胞內蛋白質原位定位的極為重要的報告分子。

2. 綠色熒光蛋白的表 達和成熟

GFP 的表達水平受多種因素的影響。在植物細胞中表達GFP 時，改變一些原GFP 基因的密碼子為該植物使用的偏愛密碼子，并消除潛在的剪接位點。目前適用于哺乳動物的表達系統不受影響。GFP 還可以順利的在無細胞的體外翻譯系統中表達并自發折疊。用一些小體積的氨基酸殘基取代大體積殘基可以提高GFP 在高溫下正確折疊的速度。這些突變位點分布于成熟蛋白質三維結構的各個部位，幾乎不能提供如何幫助GFP 折疊和成熟的線索。另外，分子伴侶的存在也有助于GFP 的折疊，反過來，這個發現也使GFP 成為檢測分子伴侶功能的一個好底物，因為GFP 可以提供一個連續的、無破壞性的檢測蛋白折疊成功的分析方法。

3. 綠色熒光蛋白的應用

3.1報告基因和細胞標記

GFP 作為報告分子和細胞標記明顯的優勢是無需底物或輔因子參與；無論在活細胞還是在完整的轉基因胚胎和動物中，都能有效地監測基因轉移的效率。但在這方面的應用中，大的缺點就是沒有放大作用，它不能象酶一樣能通過加工無數的底物分子而將信號放大所以一般都需強啟動子以驅動GFP 基因在細胞內足量的表達也可用亞細胞分辨率的顯微成像系統檢測基因產物，靶入的基因被限制于一個細胞器內，GFP 的濃度則相對提高了許多倍。

3.2融合標記

應用得多和成功的是GFP 同宿主蛋白構成融合子來監測宿主蛋白的定位和后歸宿既有熒光又有宿主蛋白原有的正常功能和定位的融合蛋白效果好的GFP 可融合于宿主蛋白的C 端或N 端，也可插入其內部迄今為止，GFP 已成功地靶入了大部分細胞器中，如質膜、細胞核、內質網、高爾基體、分泌小體、線粒體、液泡和吞噬體等。

3.3 其它

GFP 分子生色團的堅固外層保護熒光不被熄滅，但同時也降低了GFP 分子的熒光對環境的敏感性通過隨機重組和基因定向突變得到了多種對環境敏感的GFP ，它們可用作環境指示劑如：對PH 敏感GFP 的可以測定細胞器內的PH 值；通過基因工程，可GFP 在中插入磷酸化位點以便用磷酸化控制GFP 的熒光。另外，近報道的利用靶入了水母GFP 基因的絲蛋白昆蟲病毒，感染蠶的幼蟲，用改造的基因取代了蠶的正常基因，當蠶吐絲時這種絲是一種能在黑暗中發綠色熒光的纖維。

4. GFP應用特點

GFP 這一新型報告基因，在短短幾年時間內就得到了眾多研究者的青睞，其原因就在于它具有以下優點：
(1)檢測方便：因為GFP 熒光反應不需要外加底物和輔助因子，也就不存在這些物質可能難進入細胞的問題，只需紫外光或藍光激發，即可發出綠色熒光，用熒光顯微鏡甚至肉眼就可以觀察到，且靈敏度高，對于單細胞水平的表達也可識別。

(2)熒光穩定：GFP 對光漂白有較強的耐受性，能耐受長時間的光照；對高溫 (70℃) 、堿性、除垢劑、鹽、有機溶劑和大多數普通酶都有較強抗性。

(3)無毒害：從目前的研究結果來看，GFP 對生活的細胞基本無毒害，對目的基因的功能也沒有影響，轉化后細胞仍可連續傳代。

(4)共用性和通用性：首先表現在GFP 的表達幾乎不受種屬范圍的限制，在微生物、植物、動物中都獲得了成功的表達其次是GFP 沒有細胞種類和位置上的限制，在各個部位都可以表達發出熒光。

5) 易于構建載體：由于GFP 分子量較小，編碼GFP 的基因序列也很短，為所以很方便地同其它序列一起構建多種質粒，而不至于使質粒過大影響轉化頻率。

(6)可進行活細胞定時定位觀察：對活細胞中蛋白的功能研究，更能接近自然真實的狀態。通過GFP 可實時觀察到外界信號刺激下，目的蛋白的變化過程，借助于近來廣泛使用的。

5. 展望

盡管GDP 基因作為新型報告基因越累越受到關注，但必盡只是近幾年的事，對GDP 的基礎理論研究遠遠趕不上其應用的速度。目前還存在很多的問題，如除了水母外的其他發光生物（如珊瑚、水螅等）中基因的克隆、是怎樣折疊成桶狀結構的、突變是如何影響生色團形成的、熒光波長是否可以再增加以適合更多種標記和報告分子及中介轉移受體、可否在的分子內部融合其他蛋白質以及研究如何利用生物合成有色纖維、多數生物有微弱的自發熒光現象，并有著類似的激發和發射波長，影響某些GDP 的檢測，新生GDP 通過折疊和加工成為具有活性的性質，過程十分緩慢紫外激發對某些GDP 有光漂白和光破壞作用，導致熒光型號快速喪失等。隨著對GDP 的基礎理論研究的發展和新型突變體的不斷出現，我們有理由相信這些問題終會得到解決，它的開發及應用將會帶來更加廣闊的前景。

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EGFP是GFP突變系

(1)RedShifted(紅偏移)GFP突變系(EGFP & GFPS65T)
  色基發生了氨基酸取代，λmax(Excitation)偏移至490nm附近。紅偏移突變系的大激發峰都落在常用濾色片的波長范圍內，所以獲得的熒光信號要比wtGFP明亮得多。同樣，FACS和共焦顯微鏡的氬離子光源的發射波長為488nm，對RedShifted突變系的激發效率也明顯高于wtGFP。EGFP發生了雙氨基酸取代，Leu(*)取代Phe64(苯*)，Thr(*)取代Ser65(*)(Cormack et al.,1996)。基于等量溶解蛋白的光譜分析，由于Em(消光系數)的增加和色基構型的高效率，EGFP在488nm處激發后燈熒光強度為wtGFP的35倍(Cormack et al.,1996;Yang et al.,1996)。在相同條件下(489nm)測得EGFP得Em為53，000cm-1M-1，而wtGFP為9，500CM-1M-1，GFPS65T為55，000cm-1M-1(Patterson et al.,1997)。EGFP的色基構型在37℃比wtGFP或GFPS65T發光效率更高，在這一溫度下表達的EGFP可溶性蛋白95%為有效色基(Patterson et al.,1997)。GFPS65T為Thr取代Ser65的突變體(Heim et al.,1995)，同樣條件下，它的熒光強度強于wtGFP4～6倍，并且其Redshifted激發峰位于490nm，但37℃時色基形成的效率不如EGFP。

Introduction to GFP

Green Fluorescent Protein (GFP) is a 26.9 kDa protein first identified in crystal jellyfish, Aequorea victoria. It was discovered that when exposed to blue or ultraviolet light the protein fluoresces green. After GFP was first expressed in E. coli in 1994 it was soon confirmed that GFP can also be successfully expressed in other organisms as well. Since then, not only have many fluorescent proteins of different colors been generated, but their function is enhanced to provide a faster and stronger fluorescent signal.

 
GFP Applications
•GFP is often used as a reporter of gene or protein expression. By detecting GFP expression it is possible to quantify the transfection/transduction efficiency.  
•By staining the cells with propidium iodide we can monitor the viability of the culture during GFP expression. 
•In cultures that are co-transduced with GFP and RFP, the Cellometer has the capability to capture, analyze, and report the population of GFP positive, RFP positive, or dual positive.

eGFP: enhanced Green Fluorescent Protein 增強綠色熒光蛋白, EGFP是GFP突變系

目前應用 較多的是 GFP的突變體：增強型綠色熒光蛋 白( E G F P )( 6 4位苯丙一亮) ， 發射出的熒光強度 比GFP大 6 倍以上， 因此， 比GFP更適合作為 一種報告基 因來研究基因表達、 調控、 細胞分化及蛋 白質 在生物體內部定位和轉運等。綠色熒光蛋白(GreenFluorescent Protein,簡稱GFP)是一種在美國西北海岸所盛產的水母中所發現的一種蛋白質。這類學名為Aequorea victoria的水母有著美麗的外表,生存歷史超過1.6億年。1962年,下村修正是在這種水母的發光器官內發現天然綠色熒光蛋白。它之所以能夠發光,是因在其包含238個氨基酸的序列中,第65至67個氨基酸(*—*—*)殘基,可自發地形成一種熒光發色團。

熒光蛋白定位激發光源LUYOR-3260放置在物鏡前方的阻擋濾光片可根據要求規格訂做。此激發光源與護目鏡LUV-495共同使用，可在動物設備的固定位置如消毒層流柜直接觀察綠色熒光蛋白（GFP）。兩個握桿之間的空間可容納小動物的籠子。熒光蛋白定位激發光源可與熒光蛋白觀察鏡LUV-495或 LUV-590起使用直接觀察綠色熒光蛋白（GFP）或黃色熒光蛋白（YFP）。

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